酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA或ELASA）是指將可溶性抗原或抗體與聚苯乙烯等固相載體結合，利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性定量檢測方法。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是免疫學中的經(jīng)典實驗。

酶聯(lián)免疫吸附測定原理

1971年，Engvall和Perlmann發(fā)表了用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）定量測定IgG的文章，使1966年開發(fā)的用于抗原定位的酶標抗體技術被用于液體中微量物質(zhì)的檢測樣品。測試方法。
這種方法的基本原理是：
①將抗原或抗體結合到某種固相載體的表面并保持其免疫活性。
②抗原或抗體與某種酶連接，形成酶標抗原或抗體，既保留了其免疫活性，又保留了酶的活性。
測量時，待測樣品（其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按照不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體發(fā)生反應。固相載體上形成的抗原抗體復合物通過洗滌與其他物質(zhì)分離，與固相載體結合的酶量與標本中被測物質(zhì)的量成正比。加入酶反應的底物后，底物在酶的催化下變成有色產(chǎn)物，該產(chǎn)物的量與樣品中被測物質(zhì)的量直接相關，因此可以根據(jù)其進行定性或定量分析。到顏色反應的深度。由于酶的催化效率高，可以大大放大反應效果，使測定方法達到高靈敏度。

酶聯(lián)免疫吸附測定分類

常用的ELISA可分為以下五類：①直接ELISA； ②間接ELISA； ③夾心ELISA； ④競爭性ELISA； ⑤競爭性抑制ELISA。其他 ELISA 屬于或源自這五種 ELISA 的組合。

1.直接ELISA

其方法是將抗原按一定比例稀釋后包被于固相載體上，然后加入稀釋后的特異性酶標抗體，孵育后加入底物顯色并判讀結果。直接ELISA的操作非常簡單，步驟也比較簡潔，但其應用范圍仍然很有限。一個重要原因是這種ELISA只經(jīng)過一步信號放大（酶放大），因此其靈敏度不是很高；另外，其測定的對象也很有限，只能測定酶標記的分子。

2. 間接ELISA

間接ELISA與直接ELISA的區(qū)別在于，間接ELISA中非酶標抗體與包被抗原結合，并引入了二抗（即二抗）。二抗是酶標的，可以與一抗特異性結合，最后加入底物顯色并解讀結果。由于二抗一般為多克隆抗體，一個一抗分子可以結合多個二抗分子，同時一個二抗分子可以標記多個酶分子，所以當待測抗體為多克隆抗體時，信號經(jīng)過兩步放大，最終提高了檢測的靈敏度。此外，由于二抗的制備相對容易，并且很早就開始商業(yè)化，因此操作人員不需要進行一抗的酶標記，這大大減少了工作量。在檢測抗體效價、血清效價以及篩選單克隆抗體的過程中，間接ELISA是一個非常重要的實驗過程。在臨床診斷中，間接ELISA也是檢測標記抗體的重要手段。間接ELISA也是檢測標記抗體的重要手段。間接ELISA也是檢測標記抗體的重要手段。

3. 三明治 ELISA

夾心ELISA一般可分為直接夾心ELISA和間接夾心ELISA兩種。
直接夾心ELISA分為雙抗體夾心ELISA和雙抗原夾心ELISA。
雙抗體夾心ELISA的方法是將一抗（捕獲抗體）包被于固相載體上，封閉后加入待檢測抗原，孵育后加入二抗（檢測抗體）。捕獲抗體和檢測抗體可以是針對不同表位的兩種單克隆抗體，或者是針對相同抗原的一種單克隆抗體和一種多克隆抗體，但檢測抗體需要用酶標記。
雙抗原夾心ELISA的原理和操作與雙抗體夾心ELISA基本相同。
對于雙抗體夾心ELISA，待測物必須包含兩個或多個表位，否則檢測抗體無法與待測抗原結合。例如，雙抗體夾心ELISA無法檢測半抗原和小分子抗原。對于雙抗原夾心ELISA，操作與間接ELISA基本相同，但使用特異性抗原代替酶標二抗，因此特異性比間接法更好。另外，由于間接ELISA中使用的二抗一般只識別IgG，而雙抗原夾心ELISA中可以檢測任何類似的免疫球蛋白，因此雙抗原夾心ELISA也比間接ELISA更靈敏。
間接夾心 ELISA 是基于來自兩個不同物種的抗體的夾心 ELISA。洗滌后，加入另一種種屬特異性抗體（非酶標，作為檢測抗體），最后加入酶標二抗（特異性識別檢測抗體），然后加入底物顯色。與直接雙抗夾心ELISA相比，間接夾心ELISA引入了特異性識別檢測抗體的酶標二抗，相當于對整個系統(tǒng)的信號進行了一步放大系統(tǒng)，因此最終結果比直接雙抗體夾心 ELISA 更靈敏。 。同時，由于間接夾心ELISA中酶標二抗只能識別檢測抗體，而不是捕獲抗體，系統(tǒng)的特異性也得到了保證。

4. 競爭性 ELISA

該方法首先將特異性抗體吸附在固相載體表面，洗滌后分為兩組：一組加入酶標抗原與待測抗原的混合物；一組加入酶標抗原與待測抗原的混合物。另一組只加入酶標抗原，孵育、洗滌后加入底物顯色，兩組底物降解量之差即為待測定的未知抗原量。用這種方法測定的抗原只需具有一個結合位點。因此，該方法常用于激素、藥物等小分子抗原的測定。

5. 競爭性抑制 ELISA

將抗原預包被于固相載體上，實驗時加入稀釋后的待檢測抗原（或抗體），然后依次加入該抗體對應的特異性抗體和酶標二抗。待測樣品中的抗原（或抗體）與預制備系統(tǒng)中固相載體上結合的抗原（或抗體）競爭與特定抗體（或固相載體上結合的抗原）的結合。洗掉競爭性特異性抗體，最后添加底物顯色。最終的顏色結果與待檢測的抗原（或抗體）的量成反比。

實驗設計思路及基本步驟

無論哪種ELISA，其操作均由以下基本操作組成：①將抗原或抗體吸附到固相載體上； ②添加待測樣品及后續(xù)試劑； ③孵化； ④洗滌并除去游離的未結合反應物； ⑤ 添加酶檢測底物； ⑥ 結果解釋。

三明治法

夾心法常用于檢測大分子抗原。一般操作步驟為：

將特異性抗體固定（包被）在塑料孔板上，完成后洗掉多余的抗體；
添加待測樣品。如果樣品中含有待測抗原，它會與塑料孔板上的抗體特異性結合；
洗掉多余的待測樣品，加入另一種對該抗原特異的一抗，與待測抗原結合；
洗掉多余未結合的一抗，加入酶聯(lián)二抗，與一抗結合；
洗掉多余的未結合二抗，加入酶底物使酶顯色，用肉眼或儀器讀取顯色結果。

間接法

間接方法常用于檢測抗體。一般操作步驟為：

將已知抗原固定在塑料孔板上，完成后洗去多余的抗原；
添加待測樣品。如果樣品中含有待測一抗，它會與塑料孔板上的抗原特異性結合；
洗去多余的待測樣品，加入帶酶的二抗，與待測一抗結合；
洗去多余未結合的二抗，加入酶底物使酶顯色，用儀器（ELISA讀數(shù)器）測定塑料板中的吸光度值（OD值），評價顯色終產(chǎn)物的含量，從而測定抗體被測試內(nèi)容。

競爭法

競爭法是一種不太常用的ELISA檢測機制，一般用于檢測小分子抗原。操作步驟如下：

將特異性抗體固定在塑料孔板上，完成后洗掉多余的抗體；
添加待測樣品，使樣品中的待測抗原與塑料孔板上的抗體特異性結合；
添加帶有酶的抗原，該抗原也可以與塑料孔板上的抗體特異性結合。由于固定在塑料孔板上的抗體數(shù)量有限，當標本中的抗原量較多時，帶有酶的抗原能結合的固定抗體就較少，即兩種抗原都競爭結合塑料孔板上的抗體，這就是所謂競爭法的由來；
用酶洗去樣品和抗原，加入酶底物使酶顯色。當樣品中抗原的量越多時，說明塑料孔板中殘留的帶酶的抗原越少，顏色就越深。淺的。

當需要檢測無法獲得兩種以上抗體的抗原，或者難以獲得足夠的純化抗體固定在孔板上時，一般會考慮使用競爭ELISA。

進步

親和素是一種糖蛋白，一分子親和素可與四個生物素小分子產(chǎn)生特異的親和力，類似于抗原和抗體的親和力。它們之間的作用力是已知比較好的非共價相互作用。 20世紀80年代后，隨著生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）的發(fā)現(xiàn)，這種親和力被應用到ELISA技術中，大大提高了后者反應的靈敏度和特異性。生物素很容易與蛋白質(zhì)（如抗體等）共價結合。這樣，與酶結合的親和素分子與與特異性抗體結合的生物素分子發(fā)生反應，不僅起到多級放大作用，而且遇到相應的酶時，會因酶的催化作用而變色。底物，實現(xiàn)檢測。未知抗原（或抗體）分子的用途。

結果判定

定性測定

定性判定的結果是對待測樣品中是否含有待測抗原或抗體給出“是"或“否"的簡單回答，分別表示為“陽性"和“陰性"。 “陽性"表示樣本在檢測系統(tǒng)中出現(xiàn)反應。 “否定"意味著沒有反應。通過定性判斷方法也可以獲得半定量結果，即用滴度來表示反應的強度，其本質(zhì)仍然是定性檢測。在這種半定量測定中，樣品經(jīng)過一系列稀釋后進行測試，產(chǎn)生陽性反應的最高稀釋度即為效價。根據(jù)滴度可以判斷樣品的反應活性，這比通過觀察未稀釋樣品的顏色深淺來判斷強陽性和弱陽性更具定量意義。
在間接和夾心 ELISA 中，陽性孔比陰性孔更暗。相反，在競爭性 ELISA 中，陰性孔比陽性孔更暗。

定量測定

ELISA操作步驟復雜，影響反應的因素較多。特別是固相載體的包被很難達到個體間的一致性。因此，在定量測定時，每批測試必須使用一系列不同濃度的參考標準。在此條件下制作標準曲線。夾心ELISA用于測定大分子量物質(zhì)，標準曲線的范圍一般較寬，曲線最高點吸光度可接近2.0。常采用半對數(shù)值作圖，以供試品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標。將濃度值逐點連接，得到的曲線一般呈S形，頭部和尾部曲線趨于平坦，中部較為平直的部分是好的檢測區(qū)域。
小分子量物質(zhì)的測定常用競爭法，標準曲線中的吸光度與被測物質(zhì)的濃度呈負相關。標準曲線的形狀根據(jù)試劑盒中使用的模式略有不同。注意ELISA測定標準曲線中橫坐標為對數(shù)關系，更有利于測定體系的表達。

故障排除

1. 顏色很淺或沒有顏色

(1)底物成分漏加、底物失效、底物配制濃度計算錯誤；
（2）整個ELISA過程中存在抗原或抗體不匹配的情況；
(3)整個ELISA過程中樣品過度稀釋；
(4)稀釋系統(tǒng)錯誤，如使用含蛋白質(zhì)的試劑進行包被。

2、全板正極

(1)酶標抗原或抗體濃度過高，嘗試降低濃度；
(2)使用的封閉試劑不正確或未封閉；
（3）酶標抗原或抗體與系統(tǒng)中其他試劑結合；
(4)底物被酶標抗原或抗體污染。

3.顯色不均勻

(1)如果ELISA板存在質(zhì)量問題，重新檢查ELISA板的同質(zhì)性；
(2)在涂覆或加樣過程中，某些孔漏氣或加得少，可能是操作者不小心，或移液器漏氣；
(3)加樣時移液器內(nèi)注入過多氣泡；
（4）購買的ELISA板不正確，可能誤選其他用途的板；
(5)培養(yǎng)過程中平板疊放過厚；
（6）樣品添加或稀釋過程中試劑混合不充分，或稀釋梯度計算錯誤；
(7)洗板不當，有的孔未充滿洗液或加洗滌劑后洗液未充分混合，或洗板過程中帶入氣泡。

4、上色太快

(1)酶標抗原或抗體濃度過高；
(2)某種試劑濃度過高。

5、上色太慢

(1)酶標抗原或抗體濃度過低，或標記效率低，或標記后影響免疫活性；
(2)試劑被污染，如HRP酶標抗原或抗體被疊氮hua鈉污染；
(3)反應溫度太低；
(4)底物緩沖液的pH值不正確。

6.深色背景

(1)酶標抗原或抗體濃度過高；
(2) 抗體的非特異性結合；
（3）抗原、抗體不純；
(4)二抗的物種交叉識別。