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混合技術利用 Ni-NTA-Nanogold® 闡明亞蛋白結構, 揭示關鍵基因轉錄機制

更新時間:2023-10-08      點擊次數:904

迄今為止,許多生命過程背后的確切機制仍然難以捉摸,因為我們“觀察"蛋白質微小部分及其相互作用的方法受到限制。現在,一種新的混合技術利用了電子顯微鏡、納米技術、復雜的圖像處理和 3D 繪圖軟件以及標記和測量蛋白質的方法的力量。突破性的方法是從讀取 DNA 本身的物理啟動開始,揭示我們最微小的運動部件的結構和功能。

轉錄對于細胞基因的表達至關重要,即“讀取"DNA 片段以開始產生所需的蛋白質。其中一個關鍵角色是 RNA 聚合酶 II(RNAPII),它是一種從起始 DNA 合成信使 RNA 的納米機器。同樣重要的是它的助手 TFIIF,它可以識別 DNA 啟動子并向 RNAPII 發出信號,從哪里開始讀取一定長度的遺傳密碼。到目前為止,這對動態二人組相互作用背后的機制仍然難以捉摸,因為太小而無法可視化。

在中國臺灣,Wei-hau Chang 博士和他的團隊開創了一種混合技術,對這些重要蛋白質復合物的解剖結構和功能產生了深入的認識。他們超越了冷凍電鏡和 X 射線晶體學的界限,使用一種新穎的電子顯微鏡成像技術進行單顆粒分析,然后通過 FRET 分析進行微小測量,以進一步提高其繪圖的精度。他們的發現不僅解開了 TFIIF 在 RNAPII 上的位置之謎,而且還揭示了這些是移動部件,發生戲劇性的轉變以與 DNA 結合——讓我們第一次看到基因轉錄的物理起始過程。

當他們著手研究由 TFIIF 和 RNAPII 形成的 DNA 讀取復合物的結構時,Chang 等人。需要用更明顯的標簽來標記難以看到的蛋白質,然后可以用它來確定它們的確切位置。他們首先用 Nanogold®(一種單一的金納米顆粒)標記 TFIIF 蛋白的末端;黃金的電子密度很高,因此在電子顯微鏡下會顯得明亮。該團隊利用酵母中的基因表達技術,在 TFIIF 上創建了帶有 10 個組氨酸的 TAP 標簽,然后該標簽與 Nickel-NTA-Nanogold ® (Nanoprobes Inc.)緊密結合,為他們的 EM 工作提供了清晰的標記

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分析的第一階段結合了兩種成像方法和電子顯微鏡。更加散焦的視圖實際上增加了與較大物體的對比度,從而使蛋白質復合物整體成形;對于這組圖像,該小組使用了更大的 5 nm Ni-NTA-Nanogold 標記物。接下來,使用高度聚焦的圖像清晰地識別出單個微小的金納米顆粒;在這里,該小組使用 1.8 nm Ni-NTA-Nanogold 以最高精度標記他們的目標。兩個視圖共同形成了一幅圖像,顯示了微小 TFIIF 轉錄起始子的位置,以及它如何融入更大的 RNAPII 轉錄機器。軟件分析了數千個圖像對,創建了詳細的蛋白質 3D 圖譜。

第二階段的分析使用 FRET 分析帶來了更高的精度。在這里,熒光“發射機"標記被放置在 RNAPII 轉錄機上的穩定點,“受體"標記被放置在 TFIIF 蛋白上。一段時間后,接收器收集到的能量可以用來計算其與發射器的準確距離。對許多樣品的分析進一步完善了 TFIIF 蛋白在 RNAPII 復合物上的定位,結合 EM 數據創建了詳細的圖譜。

然而,Chang 的團隊所做的遠不止簡單地繪制這些蛋白質的孤立結構。他們還展示了帶有基因序列的起始前轉錄復合物,并使用他們的方法來檢查 TFIIF 起始子在遇到 DNA 啟動子時的定位。他們發現 TFIIF 會做出劇烈的物理運動作為響應,這實際上將 DNA 移向 RNAPII 轉錄機的葉/突出區域。這可能代表了轉錄起始位置的動力學選擇,并且是在行動中觀察到的基本生命過程開始背后機制的第一個視圖。

作者寫道:“我們相信這種方法對于研究許多蛋白質復合物的結構和動力學通常很有用。"他們將他們的兩步過程比作“用谷歌地圖放大"。事實上,張的團隊已經找到了一種方法來“看到"我們至關重要的納米機械中極其微小的部分,從而可以真正了解它們在創造和支持生命本身時的相互作用和功能。

“這種結合了多種技術的新技術確實為更深入地了解細胞過程如何工作打開了大門," Nanoprobes 的科學家James F. Hainfeld 博士說,該公司是Chang 技術中使用的Ni-NTA-Nanogold ®的制造商。 “這是一個以高分辨率繪制蛋白質結構圖的好工具。"

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