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金納米顆粒綴合物已廣泛應用于生物研究和生物傳感應用。例如，金納米顆粒可以用作光學或電子顯微鏡、側流免疫測定和免疫印跡方案（例如斑點印跡和蛋白質印跡）中的探針。
制備金綴合物有兩種方法，即被動吸附和通過連接體的共價偶聯。盡管制備過程相對簡單，但蛋白質對金納米顆粒的被動吸附并不能提供涂層的附著，因為隨著時間的推移，分子可能會從表面解吸。此外，在某些情況下，蛋白質在吸附到表面后會失去其特性，這可能是由于三級結構的變化或活性位點/抗原結合位點與金表面的結合使其難以接近而引起的。
盡管存在這些缺點，蛋白質被動吸附到金納米顆粒上仍然很受歡迎，并且是生成蛋白質金綴合物的簡單方法。通過被動吸附到標準球形金納米粒子來制備金納米粒子蛋白綴合物，可以使用我們方便的被動吸附金綴合優(yōu)化套件進行優(yōu)化。
與被動吸附相比，共價偶聯將感興趣的分子固定在功能化金納米顆粒上（例如帶有NHS、羧基或胺基團）。與被動吸附方法相比，這種方法大大提高了蛋白質涂層的穩(wěn)定性。共價偶聯使用與待綴合分子上的特定化學基團反應的化學接頭。因此，該方法比被動吸附方法更具特異性和可控性，并且可以針對特定應用優(yōu)化共價綴合配體的數量。通過接頭的共價偶聯還具有最小化空間位阻和對綴合蛋白三級結構的影響的優(yōu)點。總而言之，這對綴合蛋白的性質產生的有害影響較小。
我們的羧基金納米粒子、羧基金納米海膽和羧基金納米棒均依賴于 EDC/NHS 化學進行結合。 EDC 和 NHS“激活"顆粒表面的羧基，形成中間體，隨后與特定蛋白質或其他待綴合配體上的伯胺基團反應。EDC 綴合的效率通常較低，并且對 pH 值和共價鍵敏感耦合協議需要一定程度的優(yōu)化才能實現所需的性能或穩(wěn)定性。
以下方案提供了將生物分子與我們的羧化金納米顆粒偶聯的一般指南，以標準 IgG 與我們的 20 nm 羧基金納米顆粒的偶聯為例。對于其他生物分子或納米粒子類型的綴合，最佳綴合條件可能會有所不同。為了獲得與顆粒表面的最大結合，用于結合的蛋白質的量比全覆蓋所需的理論量多大約1至10倍。
20nm羧基金納米粒子
甲基金納米粒子（陰性對照）
1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)（Sigma，目錄號 E1769）
N-羥基磺基琥珀酰亞胺 (Sulfo-NHS)（Sigma，目錄號 56485）
陽性對照蛋白：辣根過氧化物酶 (HRP) 或來自人血清的 IgG（Sigma，目錄號 I4506）
阻斷劑：牛血清白蛋白 (BSA)（Sigma，目錄號 A3059）
激活緩沖液：2-(N-嗎啉代)乙磺酸 (MES) 緩沖液（10 mM，pH 5.5）
偶聯緩沖液：1X 磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)
洗滌緩沖液：1X 磷酸鹽緩沖鹽水 + 0.05% Tween 20 (PBST)
紫外可見分光光度計
待綴合的目標蛋白
注意：待綴合的蛋白質必須是純凈的且不含污染蛋白質（例如 BSA）和其他含胺成分。任何其他含有伯胺的分子都可能與待綴合的蛋白質競爭，并可能導致綴合效率顯著降低。該蛋白質還應該具有足夠的可接近的伯胺基團用于綴合。賴氨酸殘基是 EDC 綴合的主要靶位點。
如果金納米粒子的濃度低于OD 50，則通過離心濃縮它們。如果緩沖液中有顆粒，則通過離心在純水中清洗它們。有關說明，請參閱“金納米顆粒處理和儲存"。
在 MES 緩沖液中制備濃度分別為 30 和 36 mg/mL 的新鮮 EDC/NHS 混合溶液。請注意，EDC/NHS 在水溶液中會迅速水解，應在結合前新鮮制備。
取 10 µL 20 nm 金納米粒子（水中 OD 50）并與步驟 2 中制備的 10 µL EDC/NHS 混合溶液混合。
室溫孵育 30 分鐘
添加 1 mL PBST 并渦旋
6,500 g 離心 30 分鐘
除去大部分上清液
添加 10 µL 抗體（1 X PBS 中 1 mg/mL）*
在水浴超聲儀中超聲 10 秒
室溫下攪拌孵育 2 至 4 小時
添加 1 mL PBST 并渦旋
6,500 g 離心 30 分鐘
除去大部分上清液
添加 50 µL PBS 和 1% BSA
儲存于 4 度即可使用
* 蛋白質的濃度可能會根據顆粒大小和要結合的蛋白質而變化。一般來說，蛋白質的量應比全表面覆蓋的量多 1 至 10 倍。應估計顆粒的總表面積和對接面積，以計算最佳的蛋白質含量。下表是將 IgG 與不同尺寸的羧基金顆粒結合的一般參考。其他蛋白質的計算類似，但需要計算您感興趣的蛋白質的對接面積。
表 I. EDC 綴合期間不同尺寸的羧基金納米顆粒的 IgG 的建議量。 IgG 分子的對接面積估計為 45 nm2。 “NX全覆蓋量"是指孵育量與顆粒表面全覆蓋所需量之間的過量比。
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