弱染色或無染色

抗體濃度過低

• 嘗試增加一抗濃度

• 考慮使用使用生物素化二抗的擴增系統

抗體不相容性

• 確保二抗與一抗的物種和抗體亞類兼容

高背景會模糊信號

• 請嘗試遵循下面本故障排除指南的“高背景或非特異性染色"部分中詳細介紹的建議。

膜被透化試劑損壞

• 嘗試使用較低濃度的清潔劑。

• 嘗試使用較弱的清潔劑（例如用 Triton X-100 代替 Tween-20）

抗體不適合 IHC

• 有些抗體不適合 IHC 中抗原的呈現方式。檢查數據表，了解之前是否已在 IHC 或 ICC 中進行過測試，如果沒有，請考慮使用不同的抗體。

• 嘗試使用不同的固定方法，該方法將以不同的方式呈現抗原，因此可能允許抗體結合。

目標蛋白豐度低

• 嘗試增加一抗濃度

• 嘗試使用放大方法，例如生物素化二抗

固定可能會掩蓋目標表位

• 嘗試第 5.2 節中描述的抗原修復方法之一

抗體對組織切片的滲透性較差

• 嘗試將抗體孵育更長時間或以更高的濃度

• 嘗試使用更薄的組織切片

• 嘗試使用較小的一抗（例如使用 IgG 而不是 IgM）

通透性不足

• 嘗試增加緩沖液中 Triton-X100 的濃度。

• 如果使用 Tween-20，請考慮改用 Triton-X100，這是一種更強的清潔劑。

與檢測系統使用不兼容的二級熒光團

• 仔細檢查所使用的顯微鏡系統是否具有適合所使用熒光團的正確激發和發射濾光片。

• 考慮使用不同的熒光團偶聯二抗。幾乎所有熒光顯微鏡至少都配備濾光片組，能夠對 DAPI 和 FITC / Alexa Fluor 488 / Dylight 488 進行成像。

安裝后熒光團降解

• 免疫熒光切片封片后 2 天內對切片進行成像。

緩沖區退化

• 使用前檢查緩沖液的 pH 值

• 警惕細菌生長的跡象，一旦發現就扔掉。

• 必要時新鮮制作。

降解的一抗

• 確保抗體在制造商提供的最佳使用日期內。

• 考慮將來分裝抗體，快速冷凍，然后儲存在 -80°C 下，以避免抗體降解的風險。

由于光漂白而損壞熒光團共軛二抗

• 確保使用熒光團共軛二抗時執行的所有步驟都是在弱光或黑暗中進行

• 成像時盡量使用盡可能低的照明來捕獲最佳圖像。這對于共焦顯微鏡尤其重要，因為高激光功率設置可以極快地漂白一些熒光團。

• 考慮使用比 FITC 或 TRITC 等舊化合物更耐漂白的熒光團。

不兼容的緩沖區

• 一些抗體在基于 TBS 的緩沖液中表現更好，而其他抗體則更喜歡 PBS。嘗試更換緩沖液，看看這是否會增加染色。 

過度固視

• 嘗試減少組織與固定劑一起孵育的時間。

• 考慮嘗試替代固定液

多路復用時在通道之間滲透

重疊的熒光團激發/發射光譜

• 嘗試使用重疊有限的熒光團對（例如DAPI、Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594）

• 使用光譜分析工具（例如FPbase Spectraviewer）確保熒光團對之間的重疊有限。

• 嘗試使用單一抗體對照，看看一個通道中的信號是真實的還是只是由于滲漏所致。

• 一些先進的圖像分析軟件具有可以（在一定程度上）校正滲色的功能。

成像系統上的激發和發射濾光片不合適

• 檢查熒光團和濾光片之間的兼容性，以確保每個濾光片僅捕獲熒光團。

• 對于共焦顯微鏡，請考慮收緊允許進入檢測器的光波長窗口并使用測序，以便每個熒光團只有一個激光處于活動狀態。

組織形態改變

冰傷害

• 確保在未來的實驗中按照既定方案（例如本文件中列出的方案）冷凍組織。將組織切片放入 30% 蔗糖中時，確保組織已全沉沒，否則蔗糖可能沒有足夠的時間擴散到組織中。

• 考慮在分析中引入損傷評分系統，以評估冰損傷是否影響實驗結果。 

自由浮動部分的粗暴處理

• 使用網等設備可以幫助減少整個協議中組織切片所需的處理量。

• 使用優質細畫筆拾取和移動部分。確保沒有被低溫恒溫器/切片機刀片降解。

• 安裝自由浮動部分時，盡量避免接觸部分，而是使用刷子飄到載玻片上。

因儲存不當而降解

• 如果保存不當，切片可能會被微生物生長污染。考慮使用 0.05% 疊氮hua鈉來防止儲存溶液或冷凍切片中的生長

抗原修復過于苛刻

• 考慮將抗原修復方法改為不太苛刻的方法

冰凍切片從載玻片上脫落

• 確保始終對載玻片進行處理，以確保切片更有效地粘貼。雖然有商業品種，但可以按照CSH 協議等既定協議在實驗室中對載玻片進行替換； 

固定不佳

• 不全固定會導致組織迅速降解。嘗試增加組織與固定劑一起孵育的時間或考慮增加固定劑的濃度。

高背景或非特異性染色

組織切片中的自熒光分子

• 如果組織尚未灌注，請考慮在下一個實驗中進行，因為剩余的紅細胞會產生強烈的自發熒光。

• 自發熒光可能是由固定劑引起的。嘗試使用不同的固定劑。

• 確保 NaBH 4是新鮮制備的

• 嘗試用淬滅熒光的染料（例如，Pontamine 天藍、蘇丹黑或臺盼藍）孵育切片。

• 嘗試使用與自發熒光波長不同的熒光團（例如紅移染料，如 Alexa Fluor 680） 

非特異性二次結合

• 運行無初級對照以評估次級對照是否與組織切片結合。

• 如果一抗與組織來自同一物種，這可能會導致重大問題。請參閱本協議或考慮使用不同種類的一抗。 

一抗濃度過高

• 嘗試降低一抗濃度

二抗濃度過高

• 嘗試降低二抗的濃度。我們發現 1:300 至 1:500 的稀釋度是一個不錯的起點。

抗體純化不充分

• 未純化的多克隆抗體可能含有與一系列非靶蛋白發生交叉反應的抗體。檢查數據表；理想情況下，應使用免疫原作為誘餌，通過親和層析純化多克隆抗體。 

• 雖然單克隆抗體的問題較少見，但仍應至少使用 Protein A 或 G 親和層析進行純化。

• 如果有其他替代品，請考慮改用更好的純化抗體，或者如果沒有其他替代品，請考慮內部純化抗體。  

阻擋不足

• 確保封閉血清與培養二抗的物種相同。

• 嘗試使用不同的阻塞解決方案。

• 嘗試增加封閉步驟的長度或增加血清濃度

洗滌不足

• 嘗試增加洗滌的時間和/或次數。

• 確保洗滌期間有足夠的攪拌，以幫助未結合的抗體擴散出組織

一抗與組織切片來自同一物種。

• 運行無初級對照以評估次級對照是否與組織切片結合。

• 如果一抗與組織來自同一物種，這可能會導致重大問題。請參閱本協議第 4.3 節或考慮使用不同種類的一抗。

內源酶活性（用于顯色檢測）

• 嘗試用特定抑制劑阻斷內源酶活性。

對于 HRP 結合二抗，使用 0.3% H 2 O 2 10-15 分鐘。如果在此濃度下封閉不成功，請考慮增加至 3%。 

對于 AP 結合二抗，請使用 2mM 左旋咪唑。 

部分已經干了

• 確保切片始終保持濕潤，并在加濕室中使用載玻片安裝方案進行長時間孵育。

底物過多（用于顯色檢測）

• 嘗試降低底物濃度或孵育時間。

信號放大率過高（如果使用生物素化二抗）

• 嘗試降低擴增試劑或二抗的濃度。

• 考慮信號放大是否必要或者標準方法是否有效。

組織切片厚度

• 組織切片越厚，寬視野顯微鏡中的散射光越多。嘗試使用更薄的開關部分或共焦顯微鏡。